В молекулярно-генетической диагностике понятие «нестандартный объект» обозначает биологический материал, который по своим физическим, химическим или биологическим свойствам существенно отличается от стандартных биосубстратов – цельной крови, буккального мазка, ткани, полученной при биопсии. Работа с такими образцами требует применения модифицированных или специально адаптированных протоколов экстракции ДНК: стандартные наборы для выделения в таких случаях могут давать низкий выход, недостаточное качество ДНК или полностью не работать.

Объекты для выделения ДНК подразделяются по степени сложности обработки. Объекты 2 типа представляют собой промежуточный уровень сложности: они содержат достаточное количество клеточного материала для получения ДНК, однако сопряжены с определёнными преаналитическими трудностями – наличием ингибиторов ПЦР, деградацией нуклеиновых кислот, низкой клеточностью или специфической тканевой матрицей. За один объект тарифицируется единица лабораторной работы по выделению из одного образца соответствующего типа.

Примеры объектов 2 типа

К нестандартным объектам 2 типа в клинической практике относится широкий перечень биоматериалов:

• Фиксированные в формалине и залитые в парафин (FFPE) ткани.
• Сухие пятна крови на фильтровальной бумаге. 
• Смывы и мазки со слабой клеточностью – образцы из труднодоступных анатомических зон.
• Биологические жидкости с низкой клеточностью – синовиальная жидкость, перикардиальный выпот, бронхоальвеолярный лаваж с незначительным клеточным осадком.
• Биоптаты с высоким содержанием соединительной ткани или жировых включений, затрудняющих лизис клеток.
• Образцы, прошедшие длительное или ненадлежащее хранение, с частичной деградацией ДНК.

Этапы выделения ДНК из нестандартного объекта 2 типа

Протокол экстракции ДНК из объектов 2 типа включает несколько ключевых этапов, каждый из которых адаптирован к специфике конкретного биоматериала.

• Преаналитическая обработка. Для FFPE-тканей – депарафинизация ксиленом и этанолом с последующим тепловым или химическим разрушением формалин-индуцированных сшивок. Для сухих пятен – вырубка диска стандартного диаметра и элюция в буферном растворе. Для образцов с низкой клеточностью – концентрирование путём центрифугирования.
• Лизис клеток. Разрушение клеточных мембран достигается комбинацией детергентов (SDS), хаотропных агентов и протеиназы К, которая расщепляет белки, связанные с ДНК. 
• Очистка ДНК. Применяются твердофазные методы (силикагелевые мембраны или магнитные частицы), которые обеспечивают избирательное связывание ДНК, отмывку от ингибиторов ПЦР и элюцию в конечный буфер. 
• Оценка качества и концентрации выделенной ДНК осуществляется флуориметрическими или спектрофотометрическими методами перед передачей образца на дальнейшие аналитические этапы.

Контроль качества и количественный анализ полученной ДНК

После выделения проводится оценка качества и количества полученной ДНК. Для этого применяются методы спектрофотометрии или флуориметрии, позволяющие определить концентрацию и степень чистоты нуклеиновых кислот. Контроль качества необходим для подтверждения пригодности образца для дальнейших генетических исследований.

Применение результатов анализа в клинической практике

Выделенная из нестандартных объектов 2 типа ДНК служит основой для широкого спектра молекулярно-генетических исследований.

• В онкологии ДНК из FFPE-тканей используется для определения соматических мутаций – BRCA1/2, KRAS, EGFR, BRAF, MSI-статуса – с целью подбора таргетной терапии и оценки прогноза. Это особенно актуально при ретроспективном анализе архивного материала, когда свежая ткань недоступна.
• В инфекционной патологии ДНК, выделенная из жидкостей с низкой клеточностью (синовиальная, плевральная), применяется для ПЦР-диагностики специфических инфекций – туберкулёза, боррелиоза, грибковых поражений.
• В генетике и перинатальной медицине ДНК из сухих пятен крови позволяет ретроспективно подтвердить диагноз наследственного заболевания у новорождённого или провести архивный анализ при семейном обследовании.

Рекомендации по подготовке пациента и образца

Большинство объектов 2 типа представляют собой уже полученный биоматериал (хирургический образец, архивный блок, высушенное пятно), поэтому подготовка пациента в классическом смысле не требуется. 

Заключение: эффективность и надёжность метода

Выделение ДНК из нестандартных объектов 2 типа – технологически сложная, но хорошо стандартизированная лабораторная процедура. Современные коммерческие наборы и автоматизированные системы экстракции обеспечивают воспроизводимые результаты даже при работе с деградированным или малоколичественным материалом. Ключевым фактором успеха является строгое соблюдение протокола на каждом этапе – от преаналитической обработки до финальной оценки качества.

Вопросы

Как обеспечивается качество выделенной ДНК?

Качество контролируется на нескольких уровнях. Аналитический контроль включает измерение концентрации и чистоты ДНК, оценку фрагментации и постановку внутреннего контроля амплификации для выявления ингибиторов ПЦР. Операционный контроль обеспечивается использованием валидированных протоколов и сертифицированных реагентов, а также регулярным участием лаборатории в программах внешнего контроля качества.

Можно ли использовать выделенную ДНК для дальнейших генетических исследований?

Да, при условии соответствия качественным критериям. Выделенная ДНК может быть использована для ПЦР-диагностики, секвенирования по Сэнгеру, высокопроизводительного секвенирования (NGS), MLPA, фрагментного анализа и других молекулярно-генетических методов. 

Какие сложности возникают при работе с нестандартными объектами?

Основные трудности – низкий выход ДНК при малой клеточности образца, деградация нуклеиновых кислот при ненадлежащем хранении, присутствие ингибиторов ПЦР (гем, желчные соли, полисахариды тканей), а также формалин-индуцированные повреждения ДНК в FFPE-образцах. Каждая из этих проблем решается на уровне протокола: дополнительными шагами очистки, адаптацией условий лизиса, применением специализированных наборов. Тем не менее в ряде случаев – при крайне малом количестве или выраженной деградации материала – получить диагностически пригодную ДНК не представляется возможным, о чём лаборатория сообщает в заключении.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Заварин В. В. и др. Чувствительность и специфичность исследования биологического родства с использованием панели из 23 аутосомных STR-маркеров //Судебная медицина. – 2019. – Т. 5. – №. S1.
2. NeJaime D. The nature of parenthood //The Yale Law Journal. – 2017. – С. 2260-2381.
3. Ефремов Е. А., Кожемяко В. Б. Молекулярно-генетические экспертизы спорного родства по полиморфным маркерам хромосомы Х человека: особенности интерпретации результатов и расчетов индекса отцовства. Сибирский медицинский журнал. 2011. 
4. Большакова Е. С. УСТАНОВЛЕНИЕ ОТЦОВСТВА (МАТЕРИНСТВА) ПУТЕМ ПРОВЕДЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ // Мировая наука. 2018. №5 (14). 
5. Cho S, Shin E, Park YG, Choi SH, Choe EK, Bae JH, Lee JE, Lee SD. A novel approach of kinship determination based on the physical length of genetically shared regions of chromosomes. Genes Genomics. 2024 May;46(5):577-587. 
6. Geserick G, Wirth I. Genetic Kinship Investigation from Blood Groups to DNA Markers. Transfus Med Hemother. 2012 Jun;39(3):163-175.